INVESTIGACIÓN LIDERADA POR EL DR. EDUARDO CAFFERATA
“Diseño y uso de medicamentos de transferencia genética en cáncer de colon metastásico”
Marco Conceptual
Los estudios sobre cáncer han experimentado avances notables en los últimos años que han llevado a que casi el 50% de las personas que sufren algún tipo de cáncer se curan. La razón principal es la detección precoz, es decir detectar la presencia del tumor en una etapa en la cual todavía puede ser extirpado o tratado de modo tal de lograr la cura del paciente. Sin embargo, hay otro 50% de los pacientes (en especial en ciertos tipos de cáncer o en tumores detectados en forma avanzada) donde el tratamiento combinado de la cirugía más la quimioterapia tradicional no es tan efectivo. A este último grupo está dirigida la investigación en terapias genéticas que viene desarrollando nuestro grupo.
En particular venimos trabajando en el desarrollo de lo que hemos dado en llamar productos (o medicamentos) de transferencia genética o “inteligentes” (MedIn) que son dirigidos específicamente hacia el tumor tratando en la medida de lo posible de evitar que los MedIn tengan efectos colaterales indeseados sobre el tejido normal. Una de las herramientas más novedosas en términos de generar MedIn son los así llamados “virus oncolíticos”, porque pueden ser usados para atacar a las células cancerosas. Algunos de ellos, como los adenovirus, son viejos “enemigos” del hombre ya que producen resfríos muy fuertes. A los adenovirus se los comenzó a modificar genéticamente para preservar su capacidad de infectar células pero eliminando la mayor parte de su patogenicidad que de todos modos, no es más que un fuerte resfrío. Estos virus oncolíticos son habitualmente testeados en modelos de animales de laboratorio a los cuales se les induce un tumor de origen humano. Estos ratones tienen una mutación que impide que rechacen los tumores humanos permitiéndole crecer. En estudios usando estos modelos animales se pudo demostrar que un adenovirus modificado genéticamente era capaz de eliminar tumores primarios y metástasis hepáticas de cáncer de colon. El tratamiento con este virus, al que denominamos AV22EL, no sólo demostró una alta eficacia terapéutica sino que también restableció los parámetros bioquímicos normales en el animal, que habían sido alterados por el crecimiento del tumor. Además, observamos que el adenovirus “silvestre” antes de las modificaciones genéticas, podía atacar y eliminar hepatocitos humanos y células de intestino humano normales. Por el contrario, AV22EL fue incapaz de hacerlo, demostrando que no sólo tenía eficacia antitumoral sino que (mediante los cambios genéticos) era incapaz de atacar células normales de hígado e intestino.
Los trabajos sobre AV22EL fueron publicados en 2009 y se encuentra en trámite una patente que ya ha entrado en fases nacionales bajo PCT. AV22EL se encuentra ahora en etapa preclínica en animales de mayor porte antes de su uso potencial en humanos.
Descripción del Proyecto
En la búsqueda de mejorar los Medin aumentando su potencia y especificidad hay dos aspectos muy importantes en los cuales vamos a centrar nuestro proyecto. La masa tumoral no es homogénea y las células que componen el tumor no son todas iguales. Estas diferencias son por ejemplo responsables de la resistencia a los fármacos tradicionales. Es decir, un gran número de células son sensibles a cierto tipo de medicación pero otras células no y éstas últimas son las que finalmente llevan a la generación de la resistencia. Esto también ocurre con los medicamentos genéticos. El AV22EL es eficaz sobre un porcentaje determinado de las células que componen el tumor pero hay otras que son resistentes. Es decir, este virus puede entrar en gran parte de las células y eliminarlas, pero hay algunas en las que no puede entrar o si entra no las puede eliminar.
A los efectos de aumentar la potencia de AV22EL estamos generando nuevos adenovirus, basados en la estructura primaria del AV22EL y con modificaciones a nivel de su especificidad y actividad hacia los diferentes tipos de tumores de colon.
Para ello, buscamos características diferenciales de los tumores, por ejemplo, los receptores a través de los cuales AV22EL penetra dentro de la célula tumoral. La entrada del AV22EL es mediada por un receptor de la superficie celular denominado CAR, cuyo nivel está disminuido en ciertos tipos de tumores (o células) de colon, lo cual hace que el AV22EL no sea muy efectivo en este tipo de célula tumoral. Sin embargo, se ha determinado la presencia de otro receptor denominado CD46 que sí está aumentado en cáncer de colon donde CAR suele estar disminuido. Como primer paso estamos desarrollando un “nuevo AV22EL” con la capacidad de poder entrar a las células tumorales que poseen CD46. Para ello estamos modificando genéticamente la superficie del virus para que pueda unirse a CD46 y entrar a las células que lo presentan en superficie. Para ello le cambiaremos la fibra 5 al AV22EL que será reemplazada por la fibra 5/3 o 5/35 que le permiten al virus entrar a la célula a través de CD46.
Un tema adicional que abordamos en este proyecto es el hecho de que AV22EL tiene alta capacidad antitumoral en células denominadas A33-positivas pero no en células tumorales que son A33 negativas. Esto se debe a que la replicación de AV22EL depende de la presencia de A33 en las células cancerosas. En un escenario de tratamiento terapéutico las células A33-positivas serían eliminadas por AV22EL mientras que las A33-negativas serían resistentes y por ende responsables de la reaparición ulterior del tumor.
Mediante estudios previos pudimos observar que el gen CCSP2 está expresado en muchas células de cáncer de colon que suelen ser A33- negativas. Esto nos ha llevado a modificar AV22EL de modo tal que su replicación dependa de A33 y CCSP-2, lo cual permitirá que los virus oncolíticos así diseñados puedan ser efectivos en todas las variantes de células tumorales ya sea A33 +/CCSP- , A33-/CCSP2+ o A33+/CCSP2+.
En este momento estamos terminando de construir el adenovirus híbrido con A33 y CCSP-2. Las pruebas de concepto involucran una etapa inicial in vitro que abarca los estudios de especificidad, infectividad y actividad oncolítica en las diferentes líneas celulares tumorales de colon y células normales utilizadas como controles.
La segunda etapa consiste en estudios in vivo, en ratones permisivos al crecimiento de tumores humanos. Estos ratones, denominados “nude”, serán inyectados con células de cáncer de colon para generar tumores primarios y metástasis hepáticas. Una vez que los tumores adquieran un tamaño determinado, los animales serán tratados con AV22EL y los nuevos virus con las variantes de CD46 y de CCSP-2.
La tercera etapa consistirá en la prueba de los virus en muestras frescas de tumores de pacientes para poder establecer la capacidad de replicación de los diferentes virus en diversas muestras. El objetivo final consiste en intentar establecer en forma predictiva cual sería el virus más efectivo en cada paciente como una aproximación al concepto de “medicina personalizada”.
INVESTIGACIÓN LIDERADA POR LA DRA. VERÓNICA LÓPEZ
“Diseño y uso de medicamentos de transferencia genética en cáncer con énfasis en el estroma tumoral como blanco terapéutico”
Marco Conceptual
El desarrollo y la progresión de un tumor sólido hacia un fenotipo metastásico dependen fundamentalmente de las interacciones entre las células tumorales y las células del microambiente del tumor (también llamadas del estroma: fibroblastos, células de los vasos sanguíneos y células del sistema inmune). A su vez, estas células están inmersas en una matriz de diferente consistencia (según el tipo de tumor) constituida por proteínas como los diferentes tipos de colágenos, proteoglicanos, y otras. La viroterapia es uno de los nuevos enfoques de la terapia génica que se utiliza para el tratamiento del cáncer, en el cual un virus porta un gen terapéutico o su misma división (replicación) constituye el agente anticancerígeno que lleva finalmente a la muerte celular. A estos virus se los denomina oncolíticos (una muestra de ello es el producto AV22EL).
Descripción del Proyecto
Nuestra propuesta es tratar un tumor sólido (melanoma, páncreas y ovario) con un virus oncolítico que lleve modificaciones genéticas para atacar a la célula tumoral y al estroma que la está ayudando a crecer. Asimismo, proponemos modificar el virus para favorecer su dispersión en la región interna del tumor (Figura 1A).
A continuación se describen los problemas que intentaremos abordar, así como también nuestra propuesta en cada caso (objetivos específicos):
A) El virus debería ser capaz de eliminar tanto a la célula maligna como a las del estroma que sostienen su crecimiento. La actividad del virus AdF512 es regulada por una región de ADN (llamada región promotora) denominada justamente F512. Construiremos un nuevo virus con una nueva región promotora denominada PAR-1 que podría ser aún más efectiva que F512. El adenovirus más usado en terapia génica es del tipo 5 (Ad5), sin embargo este virus no infecta muy eficientemente a la mayoría de las células tumorales (excepto a las de cáncer de colon) y es necesario incrementar la capacidad infectiva de los virus. Para ello modificaremos la fibra que usa el virus para entrar en la célula tumoral por una fibra con mayor afinidad por el tumor y el estroma (ver Figura 1B). En este caso, el reemplazo es por la fibra 5/3.
B) Un problema adicional detectado en los ensayos clínicos con adenovirus oncolíticos en ciertos tipos de tumores es la limitación que tienen los mismos para distribuirse dentro del tumor. Se ha observado que el uso de unas proteínas que degradan la matriz extracelular ayuda a la penetración viral dentro del tumor. Nuestra propuesta es crear un virus que libere dentro del tumor, proteínas que rompan la matriz y faciliten su movimiento (llamadas metaloproteasas). Algunas de las que usaremos se denominan relaxina, MMP19 y MMP11.
Nuestra hipótesis general es que un adenovirus oncolítico ayudado por una metaloproteasa puede replicarse en los principales componentes de un tumor, dispersarse y generar su destrucción.
INVESTIGACIÓN LIDERADA POR LA DRA. LUCÍA POLICASTRO
“Una nanopartícula novedosa para el tratamiento del cáncer basada en el sensado de especies reactivas de oxígeno”
Marco Conceptual
Un millón de nanómetros forman un milímetro. El nanómetro es una de las más diminutas unidades de medición de las que el hombre pueda tener noción. Un grano de arena o de azúcar es de grandes dimensiones en comparación con un nanómetro. A partir de la manipulación de átomos o partículas a nivel nanométrico ha surgido la nanotecnología, una rama que conjuga los conocimientos científicos y tecnológicos, para su aplicación en diversos campos de estudio. Además de la obtención de materiales más resistentes y el mejor uso de los polímeros –grandes conjuntos de moléculas– el desarrollo de nuevos tratamientos médicos aparece como la aplicación más sorprendente de esta nueva tecnología que está revolucionando al mundo.
La nanotecnología aplicada al campo de la medicina está brindando la posibilidad de potenciar el efecto de los medicamentos ya que son transportados por nanopartículas inteligentes que se ocupan de liberarlo en las regiones de desarrollo de la enfermedad para la cual el medicamento ha sido diseñado reduciendo su llegada a órganos no afectados.
Uno de los aspectos más relevantes en la evolución de las terapias antitumorales es la necesidad de optimizar el efecto diferencial sobre el tumor con respecto a los tejidos normales. Es decir, lograr un medicamento inteligente (MedIn) que consiga discriminar entre una célula cancerosa y una normal evitando los efectos colaterales indeseables.
Una estrategia posible consiste en modular la actividad de un gen terapéutico mediante el uso de secuencias promotoras de ADN provenientes de genes diferencialmente activos en el tumor (un MedIn de este tipo es el virus AV22EL que se replica solo en células que son activas para el gen A33).
Lamentablemente, existe una gran heterogeneidad en la actividad de los genes en las distintas células tumorales, lo que lleva a que los MedIn así producidos sean activos en algunas células y no en otras. Una manera de sobreponerse a esta limitación se presenta en el proyecto de AV22EL donde se pretende que el virus sea activo en diversos tipos de células tumorales controlando su replicación como se describe allí. Otra alternativa que hemos decidido explorar es la siguiente: en lugar de que la actividad de un MedIn dependa de la actividad de un gen en una célula dada, se puede usar una característica del ambiente tumoral como los altos niveles de Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) y que el MedIn (sea este un virus o una nanoparticula) “sense” esa característica del microambiente.
Evidencias previas mostraron la existencia de elevados niveles de ROS en los tejidos malignos, específicamente una alta producción de H2O2. Sobre la base de este conocimiento generamos un MedIn capaz de “sensar” la presencia de ROS. Este medicamento genético es capaz de sensar niveles de ROS, y lo hemos denominado E6(40)VE. Por otro lado, E6(40)VE controla la actividad de un gen terapéutico denominado TK, que genera un producto tóxico capaz de matar a la célula tumoral. De este modo, nuestro MedIn E6(40)VE-TK, sensa ROS y enciende la actividad de TK en entornos con altos niveles de ROS, eliminando a la célula tumoral y se mantiene apagado en entornos con bajos niveles de ROS. Nuestro MedIn fue administrado en forma intratumoral y fue capaz de inhibir fuertemente el crecimiento de tumores de melanoma y colorrectales de origen humano en ratones “nude”. Este trabajo fue publicado en 2009 y existe una patente ya entrada en fases nacionales bajo PCT (Patent Cooperation Treaty).
Descripción del Proyecto
En su formato actual E6(40)VE es apto para ser administrado en forma intratumoral. El objetivo de este proyecto es obtener una nanopartícula basada en E6(40)VE-TK que permita su administración de manera sistémica y lograr su “redireccionamiento” hacia las regiones de presencia tumoral.
Con el objetivo de optimizar la actividad de E6(40)VE-TK se le agregará una secuencia de ADN que sea capaz de reconocer baja tensión de oxígeno, una característica adicional de los entornos tumorales. Este nuevo producto será capaz de responder a ROS, a bajas tensiones de oxígeno y a la irradiación que suele generar altos niveles de ROS, por lo que esperamos que pueda ser combinado con la irradiación habitual que se ofrece a pacientes con ciertos tipos de cáncer.
En una segunda etapa y con el fin de generar la nanopartícula, E6(40)VE-TK o sus derivados serán rodeados de complejos lipídicos capaces de encapsular a E6(40)VE-TK de manera muy eficiente y muy estable.
El direccionamiento de la nanopartícula hacia la región del tumor será dado por el agregado de un anticuerpo de camélido (VHHs) dirigido contra un blanco terapéutico localizado en la superficie de la célula tumoral. Estos anticuerpos poseen la particularidad de tener un tamaño muy reducido con respecto a los anticuerpos convencionales, no despiertan respuesta inmunológica del paciente, son muy solubles, estables y simples de producir. Estas características permitirían la aplicación repetida de inmunonanopartículas.
Se harán estudios in vitro basados en el uso de E6(40)VE-TK o sus derivados para testear la capacidad de eliminar células tumorales y no así células normales.
En una segunda etapa se harán los estudios in vivo donde se establecerá no sólo la eficacia terapéutica sino también la biodistribución de la nanopartícula.
INVESTIGACIÓN A CARGO DE LA DRA. MARCELA BOLONTRADE
“Uso de Células Madre Mesenquimales como vehículo terapéutico de genes”
Marco Conceptual
El envío terapéutico de drogas en forma sistémica hacia un tumor, esto es, a través de la circulación general, tiene como gran desventaja la falta de especificidad de una dada droga para actuar en el entorno tumoral. Así, no solo una baja proporción de la droga llega al tumor, sino que parte de la acción biológica de la droga terapéutica se da en tejidos sanos, con efectos secundarios adversos. Otra desventaja para la acción terapéutica de una droga en un tumor, es la mala conformación de los microcapilares sanguíneos, lo cual deriva en una mala circulación local y de ahí, a una falta de permisividad para la efectiva llegada de la droga hacia las zonas mas internas del tumor. Esto es un hecho muy observado en la clínica medica, intentándose contrarrestar usando mayores y más frecuentes dosis, aumentándose así los efectos secundarios no deseados.
Es deseable entonces el diseño de una terapia de acción local sobre el tumor, que imite la acción de los compuestos biológicos de síntesis local, los cuales tienen acción específica y una vez liberados a circulación son degradados, sin producir efectos adversos en tejidos sanos.
Como parte de esta estrategia de diseño terapéutico, nos concentramos en el estudio de las Células Madre Mesenquimales (MSCs por sus siglas en ingles) derivadas de médula ósea humana.
Las células madre mesenquimales son células multipotentes que se pueden aislar de diversas fuentes, incluyendo médula ósea y tejido adiposo. Las MSCs pueden ser “reclutadas” por tejidos en actividad de división celular, incluyendo tumores en desarrollo. Esta especie de memoria de las MSCs para llegar a tejidos tumorales las convierte en vehículos muy atractivos para el diseño de una terapia celular específica para vehiculizar genes o drogas terapéuticas hacia un tumor. Las MSCs pueden de este modo penetrar a zonas internas del tumor a las cuales las drogas (generalmente de gran tamaño) no vehiculizadas no llegan.
En el laboratorio identificamos una subpoblación de MSC que poseen una mayor capacidad de llegada al tumor en comparación con el resto de las poblaciones de MSC.
En nuestro grupo nos encontramos trabajando con adenovirus oncolíticos que poseen la capacidad de replicarse y eliminar a las células tumorales en forma específica usando mecanismos moleculares que nos han permitido definirlos como medicamentos inteligentes (o MedIn). Estos virus poseen dos desventajas para su uso sistémico: 1) son atacados por el sistema inmunológico del paciente; 2) su destino natural son ciertos órganos como el hígado y el bazo.
Descripción del Proyecto
A diferencia de lo descripto en los proyectos dirigidos por los Dres Cafferata y Lopez donde se intenta redireccionar a los virus cambiándoles la fibra que usan para penetrar en las células, en este proyecto proponemos “cargar” a las MSC con virus de modo tal que las MSC los transporten hacia la zona del tumor. De este modo evitamos el ataque del sistema inmunológico y los virus, una vez llegados al tumor, se replican en las MSC, las eliminan y se propagan en el tumor.
En una primera etapa nos concentramos en generar MSCs que vehiculicen un virus oncolítico denominado Ad 5/3-κBF512HRE, aunque nuestra idea es combinar esta estrategia con el resto de los virus también y con las estrategias descriptas en los otros proyectos. Este virus es una variante del Ad-F512 aunque mas potente y específico. Los primeros resultados nos están demostrando que hemos sido capaces de eliminar tumores de melanoma resistentes a los virus oncolíticos mediante su incorporación a las MSC.
La segunda desventaja, es decir aumentar la especificidad de llegada al tumor la estamos abordando de la siguiente manera. Las MSC pueden ser “redireccionadas” si se conoce cuales son los factores producidos por el tumor que “reclutan” a las MSC. Como parte de la estrategia de aumentar la llegada de MSCs al tumor estamos identificando los ejes químicos que dirigen la migración de las MSCs desde la médula ósea hasta el tumor. Hemos identificado algunos factores candidatos, presentes en líneas tumorales y ausentes en líneas normales, que correlacionan de modo positivo con la migración de las MSCs hacia el tumor. A partir de esta identificación podemos producir anticuerpos específicos que direccionen a las MSC al entorno del tumor.
Esto se hará con una estrategia de recubrimiento de MSCs con un complejo químico que permite agregar anticuerpos a la membrana de las MSCs, de modo de direccionar más aun las MSCs hacia el tumor.
Mediante esta identificación podremos “reforzar” la llegada específica de las MSCs a la zona del tumor, que sumado a la replicación del virus oncolítico dentro del ambiente tumoral, llevará al diseño de una terapia más efectiva en el tratamiento de tumores.
